1974年2月23日，祖峰出生于南京，中学就读于南京市金陵中学。

1991年，祖峰进入南京汽车制造厂工作。

1996年，考进北京电影学院表演系，并担任团支书一职。

2000年，毕业后留校任教直到2006年，期间马苏、姚笛曾成为他的学生。

2006年研读北京电影学院首届（06级）MFA表演专业研究生。

1997年，祖峰在北京人艺的小剧场中，演出过话剧《四季爱情》；同年参演个人首部电视剧《潘汉年》。

1999年，祖峰在《鲁镇传说》扮演丁家昌。

2001年，出演电影《十面埋伏》、《落网黑客》，电视剧《高原骑兵连》。

2003年，出演《沉默的证人》。

2005年，出演电视剧《温暖》和《沙家浜》。

2006年，执导电影《和顺的夏天》和《掌声响亮》。

2007年，和北京人艺合作，先后在舞台上出演了《北京大爷》、《四世同堂》以及《爱情印象》。

2008年，在电影《轮椅上的奇迹》中饰演许烽一角；同年出演《潜伏》中的李涯一角，并获华鼎奖最佳男配角奖，祖峰在《潜伏》中扮演的特务李涯也成为了经典荧屏形象；8月参演电视剧《密战》，饰国际商业间谍兼冷酷杀手蝴蝶。

2009年主演《宝贵的秘密》，饰山村青年照相师蓝宝贵；7月，参演电视剧《隐形将军》，饰玩世不恭的富家公子哥儿韩奎，逐渐成长为优秀的共产党地下工作者；9月，参演郑晓龙执导电视剧《金婚风雨情》，饰迂腐痴情的南方知识分子季诚。

2010年，祖峰参演了电影《天上的伙伴》、《建党伟业》、《宝贵的秘密》和电视剧《金婚风雨情》、《旗袍》，凭借《宝贵的秘密》入围首届澳门电影节影帝。

2011年，《爱情的印象》在话剧的舞台上，祖峰一人分饰8个不同的角色。后凭借在电视剧《旗袍》中出色的表演，再次荣获华鼎奖最佳男配角奖。

2012年，电视剧《独狼》与先前《潜伏》里深入人心的李涯形象有所不同，祖峰在《独狼》里独挑大梁；12月参演电视剧《婚战》，饰编辑孟三力。

2013年，在电影《黄金时代》扮演罗烽；4月，第三度与孔笙导演合作，参演电视剧《北平无战事》饰崔中石，获国剧盛典年度最佳男配角奖；8月参演电视剧《谋圣鬼谷子》，饰姬元伯；9月参演张艺谋执导电影《归来》，饰反派邓指导。

2014年8月，参演电视剧《刑警队长》，饰刑警胡德强；9月，客串郑晓龙执导电视剧《芈月传》，饰屈原；11月，参演电视剧《毕业歌》，饰中统特务头子季家鸣。

2015年5月，参演电视剧《双刺》，出演独具魅力的暖男特工彭刚。

2016年5月10日，祖峰曝光了一组写真大片。

2017年5月参演电视剧《欢乐颂2》，饰演奇点一角。

2018年，参演的电影《无问西东》上映。3月2日，参演的电视剧《面具》开播。6月21日，主演并导演电影《六欲天》。

2010年5月，祖峰与中央戏剧学院老师刘天池结婚。

祖峰性格内向，话不多。平日喜好练书法、篆刻、抄经、听戏、读书。他一直喜欢写信，大学读书期间每周都会给父母写家信报平安。祖峰用毛笔写给妻子的信，精致的小楷，文辞像古体诗一样优美。由于爱写字、刻章，祖峰自然对砚台以及章料石头有着兴趣。

2016年6月5日中午，周迅、吴镇宇、祖峰主演的悬疑律政电影《保持沉默》在北京举行“开庭”主题发布会，三人首度同台，畅聊片中趣事，并宣布电影定档8月19日。

出生在“六朝古都”南京的祖峰，这个城市厚重历史底蕴所累积出来的沉稳、内敛却在他身上得到了极好的体现。祖峰是一个优秀演员，虽然是个“内秀”的实力派，但他的身上显现的却是作为文人的一种硬气与执着。（中国广播网评价）

他是个兼备思考性与创造性的好演员。（李六乙评价）

祖峰的出彩总是默默的，在不张扬的动作、说话语调中，他通过眼神、身体语言等细微处理营造出来的整体氛围，总会让他扮演的人物活灵活现。（腾讯评价）

荧幕上的祖峰从来不是一个个性演员，因为他真真正正在诠释每一个“角色”，他演的不是自己，而是千万剧中人！（网易娱乐评价）

在《北平无战事》播出后，祖峰饰演的“崔中石”收获业内外一致好评，他赋予这个人物温润如玉、波澜不惊的气质，惊艳的演出获得观众青睐。在微博票选“剧中最喜欢的角色”中，祖峰以超过57%的支持率遥遥领先；“崔中石”被害依旧不改“崔叔”的超高人气，网友自发的话题“崔叔别走”讨论超过上百万。（新浪娱乐评）