2003年，在高希希执导的电视剧《历史的天空》中饰演反一号“万古碑”，为人所熟知。

2004年，参演电视剧《搭错车》，饰演反一号苏民生。

2007年，出演高希希执导的伦理情感剧《男人底线》，饰演阴冷顽固的赵通达。

2007年，参演导演高希希执导的电视剧《纸醉金迷》，饰演一个投机倒把的奸商。

2009年，在古装剧《三国》中成功饰演刘备。

2010年，于和伟、罗海琼领衔主演亲情剧《幸福在路上》。

2010年，苏岩、于和伟、王丽坤、沙溢等联袂主演心理谍战剧《青盲》，饰演张海峰。

2010年10月18日，林永健、何赛飞、辛柏青、于和伟主演的47集电视连续剧《老马家的幸福往事》举行北京电视台首播发布会。

2011年，与杨童舒、李依晓、霍青等主演都市亲情大戏《天下人家》，剧中，李依晓和于和伟饰演兄妹。

2011年，获南方盛典最佳男演员奖《幸福在路上》。

2011年，与刘威葳、刘钧、吕中、赵亮等演员联合出演家庭情感电视连续剧《大家庭》。

2012年5月22日获得MSN星月年度最具价值男演员奖。

2013年，于和伟、王丽坤领衔主演抗日谍战剧《零下三十八度》，剧中饰演的“非典型”特工。

2013年，由刘雪松导演，于和伟、王丽坤、宋春丽等演员领衔主演都市时尚情感剧《爱的多米诺》，在剧中饰演玩具设计师戴骨顺。

2013年，于和伟、刘涛领衔主演的都市情感励志大剧《下一站婚姻》，剧中于和伟变身“恐婚族”，对有着同样离异经历的单身母亲“邓草草”（刘涛饰）暗生情愫。

2014年，于和伟主演《刑警队长》。于和伟在剧中饰演男主角刑警队长顾铭，率领队友屡破大案保卫城市安全，还是一位爱妻儿孝顺父母的好男人。

2015年，于和伟饰演《搜索连》中铁血师长吴休葆，被赞演的尸体都有不一样的味道。

2015年，于和伟主演《追击者》中反一号曹若飞。

2015年，于和伟在大型古装神话剧《封神》中饰演姜子牙一角。

2015年8月9日，于和伟凭借《下一站婚姻》获第十七届华鼎奖当代剧最佳男演员奖。9月8日，于和伟红色西装亮相时尚星秀盛典，并获得年度最具实力男演员奖。同年，主演的《警花与警犬》开机，他在剧中饰演女子训犬队队长杜飞。

2016年3月2日，于和伟出演的古装大剧《军师联盟》在横店举行开机仪式后立马投入紧张的拍摄。

2017年，在电影《建军大业》中饰演陈独秀。

2017年10月，于和伟领衔出演的电视剧《绝不放手》在江苏常州举行了开机仪式。12月5日，参演的电视剧《警花与警犬之再上征程》在山东卫视播出。

2018年1月1日，获得2017国剧盛典年度匠心剧星奖。1月20日，参加“百花迎春——中国文学艺术界2018春节大联欢”。4月，获第31届飞天奖优秀男演员提名。4月16日，参演的电视剧《下一站，别离》开播。4月18日，为电视剧《下一站，别离》演唱的插曲《青春告别诗》MV上线。同日，主演的电视剧《决胜法庭》在厦门开机。4月28日，参演的电影《幕后玩家》上映。2018年，凭借《大军师司马懿之军师联盟》获得第24届上海电视节举行“白玉兰奖”最佳男配角。6月29日，参加综艺节目《向往的生活》第二季。7月6日，参演的电视剧《猎毒人》播出。8月10日，参演的电影《一出好戏》上映。

1991年于和伟与宋林静相恋，1996年，两人同时毕业，并被同时招进了南京军区前线话剧团。他们相识19年、结婚13年。

2015年12月23日，作为嘉宾出席了第30届中国电视剧飞天奖典礼。

于和伟拍戏特别认真和钻研，对艺术一丝不苟（王丽坤评价） 。而且演技精湛（搜狐娱乐）。于和伟小鼻子小眼睛的，却让人有种很信任的感觉（搜狐娱乐）。于和伟饰演的刘备，演出了他的特点，他有稳重的一面，有一代君王的英姿，而面对国家的危难，他有睿智的一面，我不认可他的江山是哭出来的这种概念（高希希评） 。