1932年出生于美国波士顿。1953年毕业于哈佛大学。早年曾攻读理论物理学，1957年在英国剑桥大学获物理学博士学位。1959年起，执教于哈佛大学，1968年任微生物学教授。从1960年开始，从事核酸结构研究。他运用桑格直读法原理，独立地提出更简便的测定核苷酸顺序的方法——化学降解法。他用化学反应将DNA裁剪成一系列不同长度的核苷酸片断，它们的一端相同，并标有放射性同位素，测定各片断的长度和另一端最后一个核苷酸，就能决定DNA相应位置上的排列顺序。若将测定过的所有片断再拼接起来，就能知道整个DNA大分子的结构。吉尔伯特是RNA世界（观念起源于卡尔·沃斯）一词的提出者。此外，他也创造了外显子（exon）与内含子（intron）两个名词，来区分mRNA分子中的两个部分。